在整個PCR體系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結(jié)果密切相關。

一、PCR引物設計原則

1、引物長度一般在15-30bp

引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應大于38bp，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應；

2、引物GC含量一般為40%-60%

引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對應的模板序列的Tm值在72℃左右

Tm值在72℃左右可使復性條件*，至少要在55-80℃之間。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是鄰近法(the nearest neighbor method)；

4、引物3’端的堿基一般不用A

引物3’端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。

5、引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

6、引物3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致PCR反應失敗。

7、如擴增編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率；

8、引物5’端可以修飾

引物5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

9、堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。

引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3’端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross Dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致引物二聚體帶的 產(chǎn)生，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

10、引物的ΔG值呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對較高。

ΔG值（自由能）反應了引物與模板結(jié)合的強弱程度，一般情況下，引物的ΔG值呈正弦曲線形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對較高。3'端的ΔG值相對要低，且值不要超過9，引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應。

11、引物應在核酸保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。

二、Real Time PCR引物設計原則

Real Time PCR用引物與普通PCR引物設計要求不同。RealTime PCR是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。